DNA納米機(jī)器是基于DNA自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)。通過嵌入多種類型的功能核酸單元，DNA納米機(jī)器可以響應(yīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性刺激物（如谷胱甘肽、microRNA等）而引發(fā)結(jié)構(gòu)變化，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞成像或治療。然而，實(shí)體腫瘤的微環(huán)境復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞周邊存在大量有重要功能的健康細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）。傳統(tǒng)的DNA納米機(jī)器往往會(huì)因?qū)嶓w瘤微環(huán)境中內(nèi)源性刺激物的影響，在其進(jìn)入靶向腫瘤細(xì)胞前被誤啟動(dòng)，對(duì)周圍健康細(xì)胞造成毒副作用損傷。因此，開發(fā)一種在細(xì)胞水平上特異性激活的納米機(jī)器，對(duì)于腫瘤的精準(zhǔn)治療具有重要意義。
細(xì)胞膜是隔離細(xì)胞與外部環(huán)境的天然屏障，通過核酸適配體與膜蛋白結(jié)合，可以使DNA納米機(jī)器在細(xì)胞膜表面進(jìn)行邏輯運(yùn)算而產(chǎn)生輸出信號(hào)。在前期研究中，鞠熀先與劉穎教授報(bào)道了基于核酸適配體和細(xì)胞膜上雙受體結(jié)合的“雙鎖-智能鑰匙”DNA邏輯門模型，并在腫瘤細(xì)胞識(shí)別與腫瘤治療中實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞亞型特異性的區(qū)分（Nat. Commun. 2016, 7, 13580）。然而，在細(xì)胞膜表面完成“邏輯門”運(yùn)算需要依賴DNA鏈在細(xì)胞膜上的遷移。這一過程依靠DNA鏈的“脫落與再結(jié)合”，效率受限，且易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。為解決這一問題，該研究組設(shè)計(jì)了一種跨細(xì)胞膜進(jìn)行DNA邏輯門運(yùn)算的納米機(jī)器（圖1a），其兩步DNA運(yùn)算分別在細(xì)胞膜上與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成，有效避免了DNA納米探針在實(shí)體瘤微環(huán)境中的非特異性激活，實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)實(shí)體腫瘤的精準(zhǔn)光動(dòng)力治療。該DNA納米機(jī)器由上轉(zhuǎn)換納米粒子內(nèi)核（UCNPs）、DNA組裝體L012和H012組成（圖1b）。含sgc8適配體的DNA鏈LA-apt與癌細(xì)胞膜上過表達(dá)的PTK-7蛋白結(jié)合，構(gòu)成信號(hào)輸入端1；癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的miRNA-21作為信號(hào)輸入端2。這兩個(gè)信號(hào)輸入端與DNA納米機(jī)器上的L012部分共同形成“AND”邏輯門。
1. (a) DNA跨膜邏輯門運(yùn)算與(b) DNA納米機(jī)器結(jié)構(gòu)示意圖。(c)以LA-apt與PTK-7蛋白結(jié)合構(gòu)成信號(hào)輸入端1、miRNA-21為信號(hào)輸入端2進(jìn)行跨膜運(yùn)算而釋放L2。(d) L2啟動(dòng)循環(huán)反應(yīng)恢復(fù)光敏劑活性。
DNA納米機(jī)器進(jìn)行跨膜邏輯運(yùn)算的過程如下：LA-apt與L012在細(xì)胞膜表面雜交，取代L1鏈后暴露miRNA-21的結(jié)合位點(diǎn)，并誘導(dǎo)納米粒子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞質(zhì)中的miRNA-21與納米粒子上的L012發(fā)生鏈取代反應(yīng)，輸出信號(hào)（即釋放的L2鏈）（圖1c）；釋放出的L2鏈打開UCNPs表面修飾的H1發(fā)卡，并隨后打開H2發(fā)卡重新釋放L2鏈進(jìn)行下一循環(huán)。這一過程可不斷恢復(fù)光敏劑的活性，在UCNPs的綠色發(fā)射光的激發(fā)下產(chǎn)生活性氧，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力治療（圖1d）。
將ROS指示劑DHR123修飾在DNA納米機(jī)器上可驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)光動(dòng)力治療。在細(xì)胞表面錨定LA-apt后，UCNPs-DNARB/BHQ孵育的MCF-7細(xì)胞在近紅外光照下有明顯的ROS產(chǎn)生（圖2a），而其對(duì)照物則不能被產(chǎn)生ROS（圖2b）。miRNA識(shí)別位點(diǎn)未被封閉的對(duì)照材料UCNPs-DNA'RB/BHQ與miRNA-21孵育后，在miRNA-21陰性的MCF-7細(xì)胞中顯示明顯的ROS熒光；而UCNPs-DNARB/BHQ此細(xì)胞中并沒有ROS產(chǎn)生（圖2c）。因此，封閉miRNA識(shí)別位點(diǎn)可保證光動(dòng)力治療僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，避免對(duì)正常細(xì)胞組織的損傷，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的精準(zhǔn)高效光動(dòng)力治療（圖2e）。
2. (a) LA-apt和(b) LA'-apt錨定的UCNPs-DNARB/BHQ處理MCF-7細(xì)胞后的共聚焦成像。(c) LA-apt錨定miRNA-21陰性的MCF-7細(xì)胞在UCNPs-DNARB/BHQ或UCNPs-DNA'RB/BHQ處理后的共聚焦成像。(d) MCF-7對(duì)照細(xì)胞與分別不同方式處理后的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞存活率。(e) MCF-7對(duì)照細(xì)胞、在UCNPs-DNARB/BHQ (LA-apt+A)、UCNPs-nrDNARB/BHQ (LA-apt+B)或UCNPs-DNA (LA-apt+C)處理后的LA-apt錨定MCF-7細(xì)胞、UCNPs-DNARB/BHQ處理后(LA'-apt+A)的LA'-apt錨定細(xì)胞的細(xì)胞增殖率。
DNA納米機(jī)器進(jìn)行光動(dòng)力治療的效果在動(dòng)物層面也得到驗(yàn)證（圖3）。通過在UCNP表面與L0鏈末端分別標(biāo)記Cy3以及Cy5，得到雙色納米機(jī)器UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5，同時(shí)發(fā)卡H1末端修飾的BHQ使Cy3熒光的猝滅。通過Cy5對(duì)DNA納米機(jī)器在活體內(nèi)的遞運(yùn)示蹤，通過Cy3的熒光恢復(fù)顯示DNA納米機(jī)器的激活。從小鼠熒光成像可看出，盡管納米材料會(huì)部分進(jìn)入肝臟，只有腫瘤處有明顯的Cy3熒光，證明該DNA納米機(jī)器的跨膜運(yùn)算僅在腫瘤細(xì)胞中激活，而不會(huì)對(duì)正常器官組織造成損傷。
3. 注射LA-apt或LA'-apt、隨后UCNPsCy3-DNABHQ-Cy5或UCNPsCy3-DNA'BHQ-Cy5小鼠的(a)活體熒光成像與(b)器官和腫瘤組織成像。
上述相關(guān)成果已以“Activating DNA Nanomachine via Computation across Cancer Cell Membrane for Precise Therapy of Solid Tumors”為題于9月2日在Journal of the American Chemical Society（DOI: 10.1021/jacs.1c06361）在線發(fā)表。張玥和陳偉偉副研究員為該工作的共同第一作者，鞠熀先教授和劉穎教授為共同通訊作者。
值得一提的是，直博生張玥在該研究組攻讀博士學(xué)位期間（2015.9-2020.8）圍繞“癌癥高效精準(zhǔn)診療中的上轉(zhuǎn)換納米探針的研制及其性能研究”取得一系性創(chuàng)新成果。她實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換發(fā)光驅(qū)動(dòng)的DNA偶氮苯納米泵用于化療藥物的可控釋放（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 18207-18211）和近紅外光響應(yīng)microRNA放大器的早期癌癥精準(zhǔn)光動(dòng)力治療（Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 21454-21459），提出近紅外光控撕裂上轉(zhuǎn)換納米膠囊的siRNA遞運(yùn)和基因治療策略（Biomaterials2018, 163, 55-66），通過近紅外光瞬間點(diǎn)燃上轉(zhuǎn)換納米炸彈，實(shí)現(xiàn)了快速藥物釋放和癌癥高效治療（J. Control. Release2021, 336, 469-479），并以共同第一作者針對(duì)siRNA運(yùn)載體系存在的靶向性與siRNA穩(wěn)定性問題，發(fā)展了一種時(shí)空可控的基因治療方法（ACS Nano2018, 12, 10797-10806）。
